結(jié)果和討論

篩選 SAC 生產(chǎn)商

SAC 生產(chǎn)的篩選包括 84 種新的烴降解分離株和 93 株來自挪威漁業(yè)科學學院 (NCFS) 的培養(yǎng)物保藏中心。 所有分離株均在補充有 1% 葡萄糖或煤油作為唯一碳源的 MBH 培養(yǎng)基中篩選。 在測試的所有分離株中，100 個分離株在至少一項定性篩選試驗（光學變形、油擴散或乳化試驗）中顯示出陽性結(jié)果。

對于 SAC 生產(chǎn)的定量評估，確定了表面張力和乳化活性。 良好的生物表面活性劑應(yīng)能夠?qū)⑺蚺囵B(yǎng)基的表面張力降低 ≥20 mN m-1 [13] 或 ≥40 mN m-1。[18] 良好的生物乳化劑的 EV24 值應(yīng)高于 50%。 19] 在 100 個陽性分離株中，只有 4 個菌株能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基的表面張力從 72 mN m-1 的未接種培養(yǎng)基降低至少 20 mN m-1（表 1）。 沒有一株分離株的 EV24 值高于 50%，但其中 18 株的 EV24 值≥19%（表 1）。 我們研究中的培養(yǎng)溫度為 13°C，低于之前研究中使用的溫度（28°C），[14,20] 可能影響了受試菌株的乳化活性。 因此，在 13°C 下 EV24 值≥20% 的分離株在 20°C 下培養(yǎng)。 結(jié)果證實，較低的生長溫度導致測試培養(yǎng)物的較低乳化活性。 11 個分離株中有 10 個在 20°C 下顯示出 EV24 >40%（表 1）。

表 1. 在葡萄糖和煤油上生長的細菌菌株的培養(yǎng)物和培養(yǎng)物濾液的表面張力和乳化值。

16S rRNA基因測序分析

通過 16S rRNA 基因序列分析對具有顯著 SAC 活性的 18 個分離株進行分類鑒定（表 2）。 紅球菌除外。 菌株 LF-13 和紅球菌屬。 在菌株 LF-22 中，大多數(shù)鑒定的 SAC 生產(chǎn)者是革蘭氏陰性菌，屬于 γ-變形菌綱。 也有報道稱 γ-變形菌在寒冷海洋地區(qū)的石油污染地點占優(yōu)勢。 [21-24] 先前對石油污染地點的研究表明，假單胞菌、假交替單胞菌、冰川、海藻和紅球菌是極地、海洋區(qū)域。[21,22,25-28]

表 2. 選定的 SAC 產(chǎn)生的分類從屬關(guān)系 基于 16S rRNA 基因測序的細菌。

已對假單胞菌屬的代表產(chǎn)生鼠李糖脂 [29,30] 和脂肽 [31-33] 和其他高分子量生物乳化劑的能力進行了深入研究。 [34,35] 紅球菌屬以其產(chǎn)生鼠李糖脂的能力而聞名。 [36-38] 具有 SAC 活性的胞外多糖 (EPS) 已被證明是由從海洋環(huán)境中分離出來的假交替單胞菌屬的幾個成員分泌的。[39-42] 耐冷假交替單胞菌屬。 從海冰樣品中分離出的菌株 CAM025 在 -2 和 10°C 下的 EPS 產(chǎn)量是 20°C 下的 30 倍。 [41] 松山等人。 [43] 描述了兩種菌株 Glaciecola chathamensis 的 S18K6T 和 S18K5 菌株產(chǎn)生 EPS 的能力。 據(jù)我們所知，迄今為止，尚未確定 Psychromonas 和 Marinomonas 屬的成員能夠產(chǎn)生 SAC。 因此，目前的分離株是產(chǎn)生 SAC 的分類群列表的補充。

生物表面活性劑生產(chǎn)

基質(zhì)

兩種細菌菌株紅球菌屬。 菌株 LF-13 和紅球菌屬。 當以煤油作為唯一碳源和能源時，菌株 LF-22 能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基的表面張力降低約 40 mN m-1。 因此，它們被選擇用于進一步表征生物表面活性劑的生產(chǎn)。 為了拓寬生物表面活性劑生產(chǎn)的底物范圍，測試了除煤油和葡萄糖之外的其他碳源（表 3）。 這兩種菌株可以在葡萄糖上生長，但不合成生物表面活性劑。 他們能夠在正十六烷和菜籽油上產(chǎn)生 SAC，即使菜籽油不支持菌株 LF-22 的生長。

表 3. 所選培養(yǎng)物中的生長和表面張力 不同碳源上的細菌分離物 (1% w/w)。

生長細胞的生物表面活性劑生產(chǎn)

菌株紅球菌屬。 菌株 LF-13 和紅球菌屬。 大約 2 天后，菌株 LF-22 達到穩(wěn)定期（圖 1）。 LF-13 和 LF-22 的培養(yǎng)物表面張力的最低值分別為 31.8 和 29.3 mN m-1，當培養(yǎng)物達到穩(wěn)定期時（圖 1）。 無細胞制劑的值顯示出與培養(yǎng)物類似的降低，表明生物表面活性劑被釋放到培養(yǎng)基中。 從工業(yè)角度來看，將生物表面活性劑分泌到培養(yǎng)基中的分離物很有趣，因為這使得生物表面活性劑的純化過程更簡單。 [16,44,45]

圖 1. (A) 紅球菌屬的生長曲線和表面張力降低曲線。 菌株LF-13； (B) 紅球菌屬。 菌株LF-22； 在以 2% 煤油為碳源的 MBH 中培養(yǎng)，20°C，160 rpm。 結(jié)果代表三個獨立實驗的平均值。

靜息細胞產(chǎn)生生物表面活性劑

為了確定生物表面活性劑的合成是否與石油烴上的細菌生長有關(guān)，在磷酸鹽緩沖液和煤油中對兩種菌株 LF-13 和 LF-22 進行了靜息細胞實驗。 紅球菌屬的細胞懸液和無細胞培養(yǎng)濾液的表面張力。 LF-13 和紅球菌屬。 LF-22 靜息細胞在培養(yǎng) 2 天后顯示出顯著減少，從 72 到 26 mN m-1（圖 2）。 結(jié)果表明，紅球菌菌株中的生物表面活性劑合成發(fā)生在煤油存在下，但不一定與煤油上的細菌生長有關(guān)。

圖 2. (A) 紅球菌屬的表面張力降低。 菌株LF-13； (B)：紅球菌屬。 LF-22 菌株，在靜息細胞條件下，含 2% (w/w) 煤油，有限氮源，20°C 和 160 rpm。 結(jié)果代表三個獨立實驗的平均值。

生物表面活性劑粗提物的產(chǎn)量約為 1.2–1.5 g/g 干燥靜息細胞。 對于紅球菌 erythropolis 菌株 DSM 43215 [46] 和菌株 SD-74 [36]，已經(jīng)建議通過靜息細胞以比生長細胞更高的產(chǎn)量生產(chǎn)生物表面活性劑。 根據(jù) Kitamoto 等人的建議，使用南極假絲酵母的靜息細胞連續(xù)生產(chǎn)甘露糖赤蘚糖醇脂質(zhì)。 [47] 估計與生長細胞的生產(chǎn)相比具有更低的成本。

粗生物表面活性劑的CMC

如材料和方法部分所述，使用 MTBE 從兩種紅球菌屬菌株的靜息細胞培養(yǎng)物中提取生物表面活性劑。 提取的生物表面活性劑用于測定CMC濃度。 來自菌株 LF-13 的生物表面活性劑的 CMC 約為 217 mg/L，菌株 LF-22 的 CMC 約為 269 mg/L（圖 3）。

圖 3. 從紅球菌屬靜止細胞中提取的 SAC 的 CMC。 LF-13 和紅球菌屬。 LF-22。

增強正十六烷的生物降解

樣品 2，僅包含含有正十六烷和來自紅球菌屬的生物表面活性劑的海水。 LF-22 沒有顯示出光密度 (OD) 的任何增加。 在 13°C 孵育 17 天后，樣品中正十六烷的量為初始量的 78.4%，略低于對照樣品（樣品 1）的 86.5%（表 4）。 由于海水經(jīng)過高壓滅菌，我們預(yù)計樣品 2 中的正十六烷不會發(fā)生任何生物降解。實驗期間表面張力沒有變化，表明添加的生物表面活性劑在海水中保持完整。

表 4. 正十六烷生物降解試驗中的細菌生長、表面張力和正十六烷殘留量（結(jié)果為兩次重復的平均值）。

用耶氏酵母的混合培養(yǎng)物 LS-DO 修正的樣品 3 顯示測得的 OD 增加了約 3 倍，表明酵母在正十六烷上生長。 17 天后，樣品中殘留的正十六烷含量為 61%（表 4）。

用酵母和生物表面活性劑修飾的樣品 4 表現(xiàn)出最高的 OD 增加，即與起始值相比增加了 4.4 倍，表明酵母在生物表面活性劑存在下生長得更快（表 4）。 正十六烷的降解率從用酵母修正時的 12 毫克/天增加到酵母和生物表面活性劑同時存在時的 30 毫克/天。 在生物表面活性劑存在下 17 天后，正十六烷耗盡。

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