摘要

空氣-水界面（AWI）上的蛋白質(zhì)組裝在許多生物過(guò)程中自然發(fā)生，并提供了一種制造生物材料的方法。然而，在A(yíng)WI中控制蛋白質(zhì)自組裝的因素以及吸附過(guò)程中發(fā)生的動(dòng)力學(xué)過(guò)程仍然沒(méi)有得到充分的探索。利用熒光顯微鏡，我們研究了在A(yíng)WI處組裝的一種模型蛋白，即用德克薩斯紅色熒光團(tuán)最低限度標(biāo)記的人血清白蛋白。在低亞相濃度下獲得靜態(tài)和動(dòng)態(tài)信息。通過(guò)改變?nèi)芤旱鞍踪|(zhì)濃度、離子強(qiáng)度和氧化還原狀態(tài)，我們相應(yīng)地改變了AWI處蛋白質(zhì)組裝的微觀(guān)結(jié)構(gòu)。pluronic表面活性劑的加入導(dǎo)致AWI發(fā)生相分離，通過(guò)光漂白實(shí)驗(yàn)后的熒光恢復(fù)顯示出流體表面活性劑結(jié)構(gòu)域和更堅(jiān)硬的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在這一競(jìng)爭(zhēng)吸附過(guò)程中，觀(guān)察到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域聚結(jié)。

1.介紹

眾所周知，蛋白質(zhì)在空氣-水界面（AWI）的行為在食品科學(xué)中對(duì)于增強(qiáng)泡沫穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)結(jié)晶以指導(dǎo)有序組裝具有重要意義。1,2它在許多生物技術(shù)應(yīng)用中也具有相關(guān)性，例如，蛋白質(zhì)溶液在平面上的行為以及在流體設(shè)備中的行為，其中蛋白質(zhì)吸附在固體水和空氣-水界面上都非常重要。3在醫(yī)學(xué)上，肺表面活性物質(zhì)和血清蛋白在肺泡水襯里層上的競(jìng)爭(zhēng)性吸附因其在急性呼吸窘迫綜合征中的作用而被廣泛研究。4,5在氣體栓塞中也很重要，在血液中，氣泡可以將蛋白質(zhì)吸收到其表面，并導(dǎo)致流向受影響區(qū)域的血流和氧氣輸送減少（即栓塞）以及凝血。6對(duì)這些過(guò)程的干預(yù)或操縱需要對(duì)蛋白質(zhì)在A(yíng)WI形成的組裝有更深入的了解。

從另一個(gè)角度來(lái)看，AWI是一種獨(dú)特的工具，用于將蛋白質(zhì)作為小的構(gòu)建單元引導(dǎo)到更大的自組裝結(jié)構(gòu)中。蛋白質(zhì)是天然存在的生物聚合物，具有非對(duì)稱(chēng)分布的掩埋和溶劑暴露的活性位點(diǎn)、靜電電荷和疏水/親水殘基。這些特征，再加上幾何約束，決定了折疊蛋白質(zhì)及其較大組裝體的結(jié)構(gòu)。組裝復(fù)雜的生物或合成系統(tǒng)的一種策略是促進(jìn)一個(gè)或兩個(gè)維度的相互作用。液體界面在這方面特別有用，因?yàn)槠渲写嬖诟飨虍愋粤投S空間限制。7-9除了液體界面的特殊特性外，通?？刂谱越M裝的因素是構(gòu)建塊的化學(xué)和結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性。10對(duì)于蛋白質(zhì)等大分子，其活性部位、幾何結(jié)構(gòu)以及靜電和疏水相互作用受到周?chē)軇┓肿雍推渌苜|(zhì)的極大影響。11,12因此，溶液條件為在A(yíng)WI處控制蛋白質(zhì)組裝提供了方便的手柄。

先前的張力測(cè)定法、反射測(cè)定法和橢偏測(cè)定法研究了AWI中蛋白質(zhì)的表面過(guò)剩變化和結(jié)構(gòu)構(gòu)象與溶液條件（如亞相濃度、pH值和離子強(qiáng)度）的關(guān)系。13-16這些技術(shù)在宏觀(guān)尺度上提供了吸附蛋白質(zhì)的整體平均特性。為了在納米到微米尺度上研究AWI的組裝結(jié)構(gòu)，已經(jīng)應(yīng)用了原子力顯微鏡（AFM）、布魯斯特角顯微鏡（BAM）和熒光顯微鏡等成像技術(shù)。17-19 AFM提供納米空間分辨率，但涉及將界面膜轉(zhuǎn)移到固體表面，這導(dǎo)致結(jié)構(gòu)保真度和時(shí)間分辨率的損失。17 BAM與Langmuir槽耦合是一種廣泛使用的原位方法，但其空間分辨率（2μm）低于許多衍射受限光學(xué)成像技術(shù)，且動(dòng)力學(xué)信息很少。18,20 Fujita等人對(duì)AWI的疏水螺旋肽組裝21和Gluck等人對(duì)多糖吸附22的開(kāi)創(chuàng)性研究表明，熒光顯微鏡有可能作為研究AWI大分子自組裝的簡(jiǎn)易原位成像工具。通過(guò)這種技術(shù)，Powers等人發(fā)現(xiàn)了在A(yíng)WI上自組裝的兩親性肽的中等依賴(lài)性微米級(jí)相域。23在這項(xiàng)具有里程碑意義的研究中所做的觀(guān)察尚未推廣到蛋白質(zhì)系統(tǒng)。在這里，我們首次證明了通過(guò)系統(tǒng)地改變?nèi)芤簵l件來(lái)控制AWI蛋白質(zhì)自組裝微觀(guān)結(jié)構(gòu)的能力。

本研究以得克薩斯紅標(biāo)記的人血清白蛋白（HSA-TR）為模型蛋白，在不同溶液條件下用原位熒光顯微鏡研究了其自組裝的微觀(guān)結(jié)構(gòu)。人血清白蛋白（HSA）提供了一個(gè)有用的模型蛋白質(zhì)系統(tǒng)，因?yàn)樗纳镂锢硇再|(zhì)已經(jīng)在溶液中和AWI中得到了很好的研究。16,24其相關(guān)性來(lái)自于一個(gè)事實(shí)，即HSA是人體血漿中最豐富的蛋白質(zhì)（3.5-5.0 g/dL），用于維持血漿脹亡壓和轉(zhuǎn)運(yùn)配體。當(dāng)氣體栓塞進(jìn)入血管時(shí)，血漿蛋白（如HSA）在氣體-血液界面吸附和聚集。25這些界面蛋白層被懷疑會(huì)影響氣泡與內(nèi)皮表面的粘附，并通過(guò)與內(nèi)皮或血小板表面上的大分子相互作用引發(fā)血液凝結(jié)。26

HSA由一條含有585個(gè)氨基酸的多肽鏈組成，其中包括35個(gè)半胱氨酸和59個(gè)賴(lài)氨酸。三十四個(gè)半胱氨酸形成17個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，單一的反應(yīng)性Cys34對(duì)氧化還原狀態(tài)極為敏感。24,27 X射線(xiàn)結(jié)晶學(xué)證實(shí)HSA具有α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，并在生理?xiàng)l件下鑒定出一個(gè)心形或等邊三角形三級(jí)結(jié)構(gòu)，一側(cè)80?，厚度30?。24反射計(jì)研究還發(fā)現(xiàn)界面處的血清白蛋白層厚度為30-40?，但蛋白質(zhì)被近似為一個(gè)橢球體，長(zhǎng)軸平行于界面140?，垂直短軸為40?。16光譜和流變學(xué)方法先前已在A(yíng)WI處發(fā)現(xiàn)單層HSA粘彈性膜，蛋白質(zhì)保留其二級(jí)結(jié)構(gòu)。16,28,29

目前的研究應(yīng)用原位熒光顯微鏡在一個(gè)小型成像室中研究AWI處的蛋白質(zhì)組裝～10μL溶液，同時(shí)限制液-固界面上的競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)吸附。形成了一個(gè)穩(wěn)定的界面，蒸發(fā)量可以忽略不計(jì)，這使得在亞微米的空間分辨率和毫秒到小時(shí)的時(shí)間尺度上可以獲得AWI處蛋白質(zhì)行為的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)信息。我們的結(jié)果揭示了在A(yíng)WI形成的微尺度蛋白質(zhì)組裝，并強(qiáng)調(diào)了溶液條件在控制組裝結(jié)構(gòu)中的作用。還觀(guān)察到AWI處的相分離動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)變。

應(yīng)用熒光顯微鏡研究了蛋白質(zhì)在氣-水界面的組裝——摘要、介紹

應(yīng)用熒光顯微鏡研究了蛋白質(zhì)在氣-水界面的組裝——材料和方法

應(yīng)用熒光顯微鏡研究了蛋白質(zhì)在氣-水界面的組裝——結(jié)果和討論

應(yīng)用熒光顯微鏡研究了蛋白質(zhì)在氣-水界面的組裝——結(jié)論、致謝！