摘要

了解DNA/脂質(zhì)相互作用的分子機(jī)制對于優(yōu)化脂質(zhì)輔因子在基因治療中的應(yīng)用至關(guān)重要。在這里我們通過使用無標(biāo)簽振動(dòng)和頻（VSF）光譜來研究DNA與陽離子脂質(zhì)DPTAP（1,2-二棕櫚酰-3-三甲基銨-丙烷）和二氫14-氨基以及兩性離子脂質(zhì)DPPC（1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿）的脂質(zhì)單層的相互作用來解決這個(gè)問題缺鈣。我們的方法的優(yōu)點(diǎn)是既能明確探測分子間的相互作用，又能洞察脂質(zhì)界面DNA周圍的水和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過研究界面D2O的OD延伸，我們發(fā)現(xiàn)，含有吸附在陽離子上的DNA的系統(tǒng)和含有吸附在兩性離子脂質(zhì)單層上的DNA的系統(tǒng)（在存在或不存在Ca2+的情況下）的水結(jié)構(gòu)存在顯著差異。陽離子體系中界面水的光譜響應(yīng)與高度結(jié)構(gòu)化、欠協(xié)調(diào)、結(jié)構(gòu)化的“類型”水一致。此外，通過對雙14-酰胺脂尾的CH拉伸模式的研究，我們證明DNA對該脂的吸附導(dǎo)致脂尾的有序性增加。

介紹

控制特定基因轉(zhuǎn)染的能力具有巨大的潛在治療效益。應(yīng)對這一挑戰(zhàn)的一種方法是使用轉(zhuǎn)基因病毒，也就是借用進(jìn)化論的解決方案來應(yīng)對生物物理挑戰(zhàn)，即將遺傳物質(zhì)從細(xì)胞外、穿過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞核。雖然這種基因轉(zhuǎn)染方法非常有效，但它不僅對特定類型的細(xì)胞具有特異性，而且常常會(huì)產(chǎn)生意想不到的毒副作用。1-5由于這些原因，在過去的20年里，人們投入了大量精力來合成輔因子，這些輔因子與細(xì)胞外的DNA復(fù)合，并將其引導(dǎo)至細(xì)胞核。由于通用性（適用于多種細(xì)胞類型）、效率（需要相對少量的DNA）和無毒性的要求，工程化這些輔因子是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

為了理解挑戰(zhàn)，有助于考慮這樣的輔助因子應(yīng)該具備的性質(zhì)。溶液中形成的復(fù)合物應(yīng)在細(xì)胞外穩(wěn)定，并應(yīng)促進(jìn)多陰離子DNA與帶負(fù)電質(zhì)膜外小葉的相互作用。接下來，在細(xì)胞攝取后，復(fù)合物應(yīng)該有助于穩(wěn)定DNA，直到擴(kuò)散使其接近細(xì)胞核。最后，復(fù)合物應(yīng)足夠不穩(wěn)定，當(dāng)相對靠近細(xì)胞核時(shí)，DNA將釋放到細(xì)胞質(zhì)中。繼15-20年前Felgner等人的開創(chuàng)性研究之后，關(guān)于這一挑戰(zhàn)的大部分工作都集中在使用陽離子脂質(zhì)作為絡(luò)合劑上。選擇6,7陽離子脂質(zhì)是因?yàn)樗鼈冊谌芤褐信c聚陰離子DNA形成不帶正電荷或稍帶正電荷的穩(wěn)定聚集體（脂復(fù)合物）。因此，脂復(fù)合物通過降低DNA的陰離子性質(zhì)，從而降低DNA接近質(zhì)膜的靜電屏障，從而滿足合成輔助因子的第一個(gè)要求。將這種脂復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率的體內(nèi)研究結(jié)果與類似復(fù)合物的體外結(jié)構(gòu)研究結(jié)果進(jìn)行比較，已闡明跨質(zhì)膜的基因轉(zhuǎn)移主要通過內(nèi)吞作用進(jìn)行，而內(nèi)體的轉(zhuǎn)移效率是聚集體結(jié)構(gòu)和電荷的函數(shù)類脂頭型。8-11脂叢結(jié)構(gòu)的體外研究，主要是X射線、中子和粗粒度計(jì)算研究，已闡明通過改變陽離子脂質(zhì)頭基的電荷，改變陽離子與兩性脂質(zhì)的比例（在由兩性脂質(zhì)+陽離子脂質(zhì)+DNA組成的脂叢中），可以靈敏地調(diào)整結(jié)構(gòu)，改變脂質(zhì)-DNA比率，改變小離子的價(jià)態(tài)和濃度也存在。12-27

雖然體內(nèi)轉(zhuǎn)染和成像研究以及體外結(jié)構(gòu)研究對于通過合成載體優(yōu)化基因轉(zhuǎn)染非常重要，但此類研究揭示的信息有限。例如，總的來說，這些方法對脂質(zhì)體形成的自由能或脂質(zhì)體內(nèi)部或脂質(zhì)體與內(nèi)體之間的詳細(xì)分子水平相互作用等潛在重要問題提供了有限的見解。為了克服前者的缺點(diǎn)，進(jìn)行了一系列的量熱法、28-31壓力等溫線和石英晶體微天平測量。31,33了解DNA/脂質(zhì)/界面水相互作用的分子細(xì)節(jié)如何影響脂質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，了解分子水平信息如何影響納米到微米尺度的結(jié)構(gòu)，然而，更為復(fù)雜。在計(jì)算領(lǐng)域，這類研究具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)閱栴}是多尺度的：理想情況下，人們希望深入了解發(fā)生在數(shù)百飛秒到分鐘的時(shí)間尺度和埃到毫米的空間尺度上的過程。24在實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，找到既能充分發(fā)揮表面敏感性又能發(fā)揮特異性的方法是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。幾位作者利用熒光技術(shù)解決了這個(gè)方程的靈敏度部分，盡管不是表面特異性。34-36雖然這些研究提供了對膜水合作用和流動(dòng)性的洞察，但這些結(jié)論通常都是間接的（通過對熒光團(tuán)響應(yīng)的變化及其局部分子環(huán)境的變化進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)校準(zhǔn)得出），并且需要使用可能干擾這一微妙系統(tǒng)的熒光標(biāo)記。

關(guān)于脂叢中分子水平相互作用的信息可以通過振動(dòng)光譜以無標(biāo)記的方式直接獲得。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，幾位作者對各種DNA/脂質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行了紅外吸光度測量。17,18,37該方法主要用于通過量化DNA特定官能團(tuán)的吸光度來測量表面的DNA量。然而，由于紅外吸收缺乏固有的表面敏感性/特異性，很少有人嘗試?yán)肈NA、脂質(zhì)或界面水模式的振動(dòng)光譜響應(yīng)的變化來理解DNA與脂質(zhì)的絡(luò)合。

在這項(xiàng)研究中，我們通過應(yīng)用振動(dòng)和頻產(chǎn)生（VSF）光譜來獲得DNA、脂質(zhì)和界面水之間相互作用的分子水平圖像，從而克服了表面特異性/敏感性的挑戰(zhàn)。VSF是一種二階非線性光學(xué)技術(shù)，其中脈沖可見光和紅外激光束在空間和時(shí)間的界面上重疊，并在兩個(gè)輸入頻率的總和上產(chǎn)生發(fā)射。根據(jù)對稱性選擇規(guī)則，和頻過程是特定于界面的（在具有反轉(zhuǎn)對稱性的體相之間），并且是振動(dòng)光譜，因?yàn)楫?dāng)紅外光束的能量與界面分子的分子振動(dòng)共振時(shí)，發(fā)射可以增加許多數(shù)量級(jí)。也就是說，VSF光譜是一種界面特定的振動(dòng)光譜，非常適合描述水界面的分子結(jié)構(gòu)。38-40之前的工作已經(jīng)證明了VSF光譜（及其非共振模擬二次諧波產(chǎn)生（SHG）光譜）的適用性，可用于定量小分子（小于20 bp）主要是單組分單鏈和雙鏈DNA的雙鏈形成和DNA構(gòu)象，共價(jià)連接到固體基質(zhì)，41-47以及在水/脂質(zhì)/空氣界面上更長的DNA鏈的脂質(zhì)-DNA相互作用。48目前的研究表明，VSF光譜有助于闡明脂質(zhì)、界面水和任意組成的DNA鏈之間的分子水平相互作用。

盡管如上所述，有很多證據(jù)表明脂質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)染效率是脂質(zhì)頭基電荷密度的函數(shù)（對于陽離子脂質(zhì)），但并非所有陽離子脂質(zhì)都適合這種應(yīng)用。一般來說，轉(zhuǎn)染效率的提高（隨著脂質(zhì)濃度的增加）和細(xì)胞毒性（部分原因是脂質(zhì)和硫酸化表面蛋白多糖組之間的相互作用10）之間存在權(quán)衡。事實(shí)上，我們之前研究中使用的陽離子脂質(zhì)，48 1,1-二棕櫚酰-3-三甲基丙烷銨（DPTAP），已知在遠(yuǎn)低于可觀的基因轉(zhuǎn)染所需濃度時(shí)對哺乳動(dòng)物細(xì)胞有毒。在這里，我們通過進(jìn)一步報(bào)道DNA與（i）陽離子脂質(zhì)diC14-氨基的相互作用來擴(kuò)展我們之前的工作，過去15年的大量工作證明了其低毒性和基因轉(zhuǎn)染的適用性；49和（ii）無毒的兩性離子脂質(zhì)二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC），無論是否存在鈣（其中研究了鈣的添加，因?yàn)橹暗母鞣N研究已經(jīng)證明，在存在這種離子的情況下，DNA和DPPC之間的相互作用變得更有利16-19,31,33,50）。我們通過監(jiān)測DNA吸附時(shí)OD拉伸（在界面D2O或HOD中）的振動(dòng)振幅和線形的變化，直接跟蹤DNA與每種脂質(zhì)類型的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)，與之前采用其他技術(shù)的研究一致，這種相互作用本質(zhì)上主要是靜電作用：陽離子脂質(zhì)與DNA的相互作用類似，并且這種相互作用在鈣存在和不存在的情況下都不同于DNA和DPPC。

此外，由于我們對雙14-氨基特別感興趣，我們還量化了DNA與該單層的相互作用如何導(dǎo)致脂質(zhì)尾部的有序化（通過VSF光譜和壓力/面積等溫線）。在之前的一項(xiàng)研究中，Benatti及其同事利用電子自旋共振光譜和自旋標(biāo)記脂質(zhì)探索了DNA在雙氰胺雙分子層相上的吸附效應(yīng)，以及溫度對吸附的影響。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，DNA的吸附使凝膠相雙14胺（低于23°C）流態(tài)化，并使流體雙層（高于23°C）：隨著溫度的升高，DNA的吸附起到了平滑凝膠/流體相變的作用。因此，我們的VSF觀察結(jié)果提供了一個(gè)分子水平的視圖，使用一個(gè)無標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)探針，觀察了伴隨這一diC14氨基/DNA相的脂質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)的變化。總的來說，這些結(jié)果表明，VSF光譜學(xué)在脂叢形成研究中的應(yīng)用使我們能夠看到脂叢結(jié)構(gòu)的各個(gè)方面，而這些方面很難通過其他手段進(jìn)行研究，因此，VSF光譜學(xué)是優(yōu)化合成基因治療的有用工具。

方法

實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。本研究中使用的D2O是從劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室（MA）獲得的，純度為99.96%，用于接收。對本研究中使用的H2O進(jìn)行蒸餾，然后使用微孔裝置進(jìn)行過濾，最終電阻率為18.2m?·厘米1,2-二棕櫚酰-3-三甲基銨-丙烷（DPTAP）和1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DPPC）從Avanti Polar Lipses（AL）購買，前者作為氯鹽，并在收到時(shí)使用。使用之前發(fā)布的程序49合成了雙氰胺（所有脂質(zhì)結(jié)構(gòu)見圖1）。λ-噬菌體DNA（每個(gè)分子的長度由制造商指定為48 502個(gè)堿基對）從德國酵素公司購買，并在H2O中接收。在我們的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，我們需要D2O中的DNA。為此，使用QIAEX II凝膠提取試劑盒（Qiagen）從H2O中提取DNA，然后溶解在TRIS緩沖D2O（10 mM TRIS HCl，pD）7中。該程序重復(fù)三次，以確保低濃度的H2O和最終的DNA回收≈80%（通過260 nm處的DNA吸光度進(jìn)行量化）。我們沒有確認(rèn)該樣本制備程序保留了DNA鏈長度。

圖1.（A）雙14酰胺的分子結(jié)構(gòu)；（B）DPTAP；和（C）DPPC。

我們的VSF光譜設(shè)置已經(jīng)在前面詳細(xì)描述過。51簡言之，我們采用了一種再生放大鈦寶石系統(tǒng)（Legend，Coherent，Inc.），該系統(tǒng)經(jīng)過優(yōu)化，可用于生產(chǎn)鈦寶石≈100fs脈沖，中心波長為800nm，帶寬為12nm；使用商用光學(xué)參量放大器和差頻產(chǎn)生裝置（TOPAS，light Conversion，立陶宛）將800 nm光的1 mJ/脈沖用于產(chǎn)生可調(diào)諧的中紅外脈沖，而使用一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)具（用于聚焦于CH拉伸的測量）將0.5 mJ的光譜變窄。在產(chǎn)生IR和800 nm光譜變窄后，兩束光束都通過半波片和偏振器，并以相對于表面法線（分別為IR和可見光）40°和35°的反射幾何結(jié)構(gòu)撞擊樣品。采樣后，過濾掉所有剩余的800 nm光，將VSF信號(hào)聚焦到光譜儀（Acton Instruments）中，在光譜儀中通過光柵將其分散，并聚焦到電子倍增電荷耦合器件（emCCD）攝像機(jī)（牛頓和或）上。本研究中報(bào)告的所有光譜均在ssp偏振條件下收集（s偏振SF、s偏振可見光、p偏振紅外）。所有測量均在21.5°C下進(jìn)行。

在這項(xiàng)研究中，我們對OD和CH拉伸區(qū)域的光譜響應(yīng)感興趣，分別為紅外頻率的2100-2700和2800-3000 cm-1。由于紅外光源的帶寬小于OD拉伸振動(dòng)的線寬，我們需要通過系統(tǒng)地改變TOPAS中兩個(gè)非線性晶體相對于入射光的角度來掃描紅外頻率。這個(gè)過程的結(jié)果是，紅外功率在我們期望的頻率范圍內(nèi)是不均勻的。我們通過將所有脂質(zhì)/DNA光譜除以相同頻率范圍內(nèi)的光譜（從z切石英測量）來糾正這種不均勻性。我們的TOPAS/差頻發(fā)生器在產(chǎn)生3400 cm-1以上頻率的光時(shí)效率相對較低。正是出于這個(gè)原因，我們研究了D2O和HOD的OD延伸，而不是H2O和HOD的OH延伸。我們和其他人的廣泛比較發(fā)現(xiàn)，OD光譜可以線性縮放以定量恢復(fù)OH光譜：用重水代替光不會(huì)影響分子結(jié)構(gòu)（在VSF光譜中可見的程度）。

之前的一些研究使用VSF光譜法對含有末端附著在固體表面上的DNA的系統(tǒng)的CH拉伸頻率區(qū)域進(jìn)行了研究，報(bào)告了來自DNA43,44的VSF活性CH模式，而其他研究則沒有。42,45那些觀察到DNA CH模式的研究以其核堿基序列的相對簡短和簡單而著稱。我們的DNA鏈比這些研究中使用的DNA鏈長2000-5000倍，物理吸附在界面上（因此可能具有較小的長程順序），并且化學(xué)上不均勻。這些考慮表明，正如我們確實(shí)發(fā)現(xiàn)的那樣，在我們的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，DNA本身沒有VSF活性CH模式。

脂質(zhì)儲(chǔ)備溶液在氯仿中制備。在有無DNA的情況下，通過在含有D2O和tris緩沖液的亞相上滴加這些儲(chǔ)備溶液制備單層。光學(xué)分析是在自制的聚四氟乙烯槽中制備的樣品上進(jìn)行的。使用商用張力計(jì)（芬蘭基布隆）對這些水槽中的表面壓力進(jìn)行量化。高分辨率壓力（π）/面積等溫線是在帶有移動(dòng)屏障的商用槽（微型槽X，Kibron，芬蘭）上測量的。

數(shù)據(jù)分析。最后，我們希望比較不同振動(dòng)模式的光譜振幅和線型，作為亞相DNA濃度的函數(shù)。由于VSF是一種相干光譜，并且我們的數(shù)據(jù)包含可能會(huì)干擾的多個(gè)共振，因此很難通過檢查原始數(shù)據(jù)來推斷光譜振幅。根據(jù)之前的作者，我們通過將和頻響應(yīng)建模為洛倫茲的集合，并附加非共振貢獻(xiàn)（其中（2）是二階磁化率，Iv是入射可見光場的強(qiáng)度，Iir是入射紅外場的強(qiáng)度，Anr是非共振振幅，φnr是非共振相位，An是振動(dòng)模n的振幅，ωn是振動(dòng)模n的中心頻率，ωir是紅外場的頻率，Γn是振動(dòng)模n）52的均勻線寬

在下面的內(nèi)容中，我們主要感興趣的是比較提取的光譜振幅除以線寬：An/Γn。為了便于與測量的和頻強(qiáng)度進(jìn)行比較，我們繪制（An/Γn）2。我們通過使用等式1擬合數(shù)據(jù)并在商用分析和繪圖程序Igor Pro（Wavemetrics，OR）中實(shí)現(xiàn)Levenberg-Marquardt算法來提取這些量。如下文所述，我們主要感興趣的是使用這種數(shù)據(jù)擬合來提取光譜振幅隨DNA濃度變化的定性趨勢。因此，我們沒有嘗試在數(shù)據(jù)分析中詳盡地探索模型參數(shù)的相空間。