結(jié)果和討論

界面水的光譜響應(yīng)。圖2顯示了在2100-3100 cm-1范圍內(nèi)，隨著亞相DNA濃度的增加，DPTAP、diC14氨基和DPPC單分子膜的VSF光譜。對這些數(shù)據(jù)的粗略檢查顯示出幾個(gè)特征。聚焦于圖2面板A，從低頻向高頻移動(dòng)，很明顯，有一個(gè)巨大的雙峰結(jié)構(gòu)，隨著DNA的加入，其振幅突然降低（透明的紅色矩形）；一個(gè)小的、更高頻率的峰值（以≈2675 cm-1），隨著DNA（透明綠色矩形）的加入而增加；在2800-2950 cm-1的頻率范圍內(nèi)有幾個(gè)較窄的峰值（這些峰值是CH拉伸振動(dòng)的結(jié)果，顯示在一個(gè)透明的藍(lán)色矩形中，下面將進(jìn)一步討論）。

圖2。VSF光譜是OD拉伸區(qū)2100-2700 cm-1和CH拉伸區(qū)2850-2975 cm-1的DNA濃度的函數(shù)。陽離子脂質(zhì)單分子膜的脂質(zhì)密度為52?2/分子，兩性離子脂質(zhì)單分子膜的脂質(zhì)密度為47?2/分子。A組為DPTAP單層下的VSF光譜，B組為diC14氨基單層下的VSF光譜，C組為DPPC單層下的VSF光譜，D組為含有額外50 mM CaCl2的DPPC單層下的VSF光譜。所有實(shí)驗(yàn)中的亞相都是磷酸鹽緩沖的。每個(gè)面板中的單個(gè)光譜是具有不同濃度λ-DNA噬菌體的相同系統(tǒng)。每個(gè)面板中都顯示了該頻率窗口的磷酸鹽緩沖D2O光譜，以供比較。實(shí)體曲線使用公式1擬合數(shù)據(jù)。

在沈氏集團(tuán)38-40的開創(chuàng)性努力之后，20年的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算工作已經(jīng)闡明，大型雙峰結(jié)構(gòu)是界面氫鍵水的OD延伸（見里士滿、戈帕拉克里希南等人、奧斯特羅霍夫和沈和艾倫等人的評(píng)論，以及其中的參考文獻(xiàn)53-56）。最近，我們已經(jīng)證明，這兩個(gè)峰并不是由界面水的兩種不同結(jié)構(gòu)類型造成的：它們是一個(gè)單峰，由于OD拉伸的費(fèi)米共振和D2O彎曲的0 f 2躍遷而明顯傾斜。57-59下面將進(jìn)一步討論，這種費(fèi)米共振可以“關(guān)閉”，通過探測界面HOD中的OH或OD拉伸模式，產(chǎn)生的光譜只有一個(gè)峰值。有了這樣的HOD光譜，界面水結(jié)構(gòu)的半定量解釋成為可能，即具有不同狀態(tài)的連續(xù)統(tǒng)。

移動(dòng)到更高的頻率，在2675厘米-1處有一個(gè)小峰值。在沒有DNA的情況下，該峰值不會(huì)出現(xiàn)在水/脂質(zhì)界面上，并且在該頻率窗口中沒有出現(xiàn)已知的DNA共振。之前關(guān)于空氣/水界面（水相可能含有酸、堿或鹽）界面水OD（OH）延伸的許多研究表明，在較低頻率下具有雙峰特征，在較高頻率（2735 cm-1）下具有更窄的峰。53,54,56,60,61基于真空中孤立水分子的OD拉伸模式和高水平計(jì)算，很明顯，以2735 cm-1為中心的峰值是自由OD：一種D2O分子，橫跨空氣/水界面，其方式使一個(gè)OD粘附在氣相中（參見圖2中的空氣/水光譜）。由于我們觀察到的峰值頻率均低于自由OD，且僅出現(xiàn)在DNA存在的情況下，因此最容易通過水直接但微弱地氫鍵連接到DNA或DNA吸附來解釋它，從而產(chǎn)生一種在沒有水的情況下不存在的結(jié)構(gòu)類型的水（例如，疏水袋）。下面將進(jìn)一步討論此任務(wù)的限制。

通過考慮從圖2中的數(shù)據(jù)中提取的強(qiáng)度（即（An/n）2），我們可以更容易地討論這些光譜特征。對于低頻、大OD峰值（圖2A中透明紅色矩形內(nèi)的光譜特征）的這種方法的結(jié)果如圖3所示（對于所有系統(tǒng)，OD強(qiáng)度在沒有DNA的情況下由信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化）。這些結(jié)果量化了我們在圖2中的定性印象：將DNA的體積濃度從0增加到40 pM，會(huì)導(dǎo)致吸附在陽離子脂質(zhì)DPTAP或diC14氨基上的DNA的OD強(qiáng)度損失超過80%。在兩性離子脂質(zhì)DPPC下面增加DNA濃度，導(dǎo)致OD強(qiáng)度從0降低到80 pM DNA，但總損失僅為初始值的20%。最后，在我們的第四個(gè)系統(tǒng)中，在50 mM CaCl2存在的情況下，增加DPPC單層下的DNA濃度會(huì)產(chǎn)生介于這兩個(gè)極端之間的光譜響應(yīng)：隨著DNA濃度的增加，低頻OD拉伸峰的強(qiáng)度降低≈70%.山頂≈2675 cm-1僅適用于DNA吸附到DPTAP和雙氰胺上的系統(tǒng)（見圖2A，B）。如果我們使用公式1來量化該峰值的強(qiáng)度，我們將得到圖4所示的結(jié)果。對于這兩種脂質(zhì)，其趨勢是相同的：強(qiáng)度迅速增加，飽和于≈40μm的DNA體積濃度，此后振幅略有下降。當(dāng)我們在下面進(jìn)一步討論這個(gè)峰的詳細(xì)分配時(shí)，我們注意到DNA鏈中的OH基團(tuán)只存在于鏈的末端：對于每個(gè)DNA鏈，只有兩個(gè)末端OH基團(tuán)。由此產(chǎn)生的DNA OH基團(tuán)的密度為每小時(shí)1個(gè)≈15000 nm2；足夠小，以至于DNA OH基團(tuán)的密度太低，無法引起任何觀察到的光譜變化。

圖3。根據(jù)圖2中的數(shù)據(jù)擬合氫鍵OD拉伸強(qiáng)度（即（An/n）2）。氫鍵OD拉伸峰在圖2A中的透明紅色矩形中突出顯示。這些結(jié)果清楚地表明，雖然所有脂質(zhì)單分子膜下的OD強(qiáng)度隨著DNA濃度的增加而降低，但帶電脂質(zhì)下的變化要大得多。

圖4。圖2面板A和B中所示光譜的“弱”O(jiān)D拉伸峰的擬合光譜強(qiáng)度。這些結(jié)果清楚地表明，上述“弱”O(jiān)D拉伸峰的強(qiáng)度穩(wěn)定≈30 pM的DNA體積濃度。

原則上，我們數(shù)據(jù)中的每一個(gè)振動(dòng)模式都包含三個(gè)可觀測值：光譜振幅、線型和基礎(chǔ)模式的中心頻率。圖3和圖4所示的強(qiáng)度受前兩個(gè)因素的影響，基本上我們觀察的是總的積分光譜強(qiáng)度，但不涉及第三個(gè)因素。對于DNA/DPPC和DNA/DPPC/Ca2+系統(tǒng)，圖2面板C和D的檢查表明，這種從光譜中提取信息的方式是合理的：中心頻率沒有明顯的變化。對于DNA/DPTAP和DNA/diC14氨基系統(tǒng)，情況更為復(fù)雜。例如，對于DNA/DPTAP系統(tǒng)，很明顯～相對于主峰，強(qiáng)度增加2500 cm-1～2400 cm-1，隨著DNA濃度的增加。下面將更詳細(xì)地討論基本模式的這種明顯的頻率偏移是否對應(yīng)于實(shí)際的頻率偏移。

因此，我們對這些系統(tǒng)的OD拉伸頻率區(qū)域有三個(gè)主要觀察結(jié)果。（i）隨著DNA的加入，低頻峰的積分光譜強(qiáng)度降低。光譜響應(yīng)的強(qiáng)度與靜電相關(guān)：陽離子脂質(zhì)單分子膜下的界面水比兩性離子單分子膜下的界面水對多陰離子DNA的吸附更敏感。在Ca2+存在下，兩性離子單分子膜下方的水（被認(rèn)為使兩性離子單分子膜名義上具有陽離子16）具有中等靈敏度。（ii）在陽離子單分子膜下，這種OD拉伸模式的中心頻率可能會(huì)隨著DNA的加入而移動(dòng)（因?yàn)樗鼤?huì)降低振幅）；在兩性離子單分子膜下，它不會(huì)。（iii）OD拉伸峰出現(xiàn)在更高的頻率，2675 cm-1，僅在陽離子單分子膜下方存在DNA的情況下。為了理解這些觀察對于分子結(jié)構(gòu)的意義，我們需要更詳細(xì)地考慮能夠影響VSF光譜響應(yīng)的因素。

隨著DNA濃度的增加，有五個(gè)因素可能會(huì)導(dǎo)致OD拉伸光譜響應(yīng)的變化。（i）由于脂質(zhì)與聚陰離子DNA的相互作用，DC界面場可能會(huì)發(fā)生變化（其中初始場是帶電脂質(zhì)頭基（DPTAP和diC14氨基）和兩性離子頭基（DPPC）偶極子的結(jié)果，伴隨DNA吸附的場變化預(yù)計(jì)只會(huì)調(diào)制光譜振幅）。（ii）新結(jié)構(gòu)類型的水（與新受體或供體氫鍵的水）的產(chǎn)生，預(yù)計(jì)會(huì)改變OD拉伸中心頻率和線型，并且其他類型界面水的密度保持不變，導(dǎo)致光譜振幅增加。（iii）被吸附的DNA可以置換界面水，導(dǎo)致界面水分子數(shù)量減少（如果DNA置換所有“類型”的水的程度相同，這種置換只會(huì)導(dǎo)致光譜振幅降低）。（iv）DNA的吸附可能會(huì)產(chǎn)生額外的非中心對稱區(qū)域（即，脂質(zhì)-水界面可能會(huì)改變?yōu)橹|(zhì)-水-DNA-水界面）。如果吸附在DNA螺旋另一側(cè)的水分子發(fā)生破壞性干擾，這將導(dǎo)致光譜振幅降低。（v）吸附的DNA可能會(huì)導(dǎo)致界面水分子重新定向，從而使它們的OD拉伸振幅（在我們的實(shí)驗(yàn)幾何中很明顯）顯著降低。

效應(yīng)（iv）表明，DNA的吸附產(chǎn)生了大量新的界面水。對DNA結(jié)構(gòu)的檢查表明，這種水很可能是氫鍵結(jié)合在雙螺旋外部的磷酸鹽上。然而，對水合雙層膜進(jìn)行的大量紅外和模擬研究表明，磷酸鹽是比大量水更好的氫鍵受體：吸附到DNA上的VSF活性水的增加應(yīng)導(dǎo)致OD拉伸帶中心頻率的紅移。62,63當(dāng)我們看到含有陽離子脂質(zhì)的系統(tǒng)的該頻帶向更高頻率轉(zhuǎn)移，而含有DPPC的系統(tǒng)的該頻帶沒有轉(zhuǎn)移時(shí)，這種效應(yīng)似乎不太可能起到顯著作用，因此不再進(jìn)一步討論。界面水VSF光譜響應(yīng)的偏振分析表明，我們看到的氫鍵OD拉伸強(qiáng)度的振幅降低（圖2面板A中的紅色特征）將需要水分子重新定向超過60°（相對于表面法線）。60據(jù)我們所知，沒有對于這種或任何其他水性界面，存在這樣的極端重新取向的獨(dú)立證據(jù)，我們也沒有進(jìn)一步考慮效應(yīng)（V）。在下文中，我們更詳細(xì)地考慮效應(yīng)（I）-（III）。

許多以前的工作已經(jīng)證明，由于界面液體分子定向力較弱的表面場減小，或由于（3）對和頻信號(hào)的貢獻(xiàn)減小，或兩者兼而有之，和頻強(qiáng)度隨著表面電位的降低而降低。64-66 McLoughlin等人已經(jīng)證明，DNA吸附到陽離子脂質(zhì)DODAB（二十八烷基二甲基溴化銨）上會(huì)導(dǎo)致≈0.3 V，而在Ca2+存在下，兩性離子脂質(zhì)DSPC（二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿）對DNA的吸附（未測量裸DSPC單層在DNA存在下的表面電位變化）導(dǎo)致表面電位降低小于0.1 V。如果我們假設(shè)DPTAP和雙氰胺表現(xiàn)類似對于DODAB和DPPC，與DSPC類似，光譜響應(yīng)隨DNA吸附的變化似乎定性地映射到電位降低：DNA吸附到陽離子脂質(zhì)上導(dǎo)致比吸附到兩性離子上更大的表面電位降低，前者顯示氫鍵OH拉伸強(qiáng)度比后者更大的降低。

這些表面電位和OD拉伸強(qiáng)度的定性趨勢也與之前的許多X射線、模擬和熱力學(xué)工作一致。已知DNA對含有陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)單層或雙層具有相對較強(qiáng)的吸附（伴隨著相對較大的表面電位變化），并具有相對較高的最大吸附密度。對于含有陽離子單分子膜的系統(tǒng)，我們看到界面水對DNA存在的最強(qiáng)光譜響應(yīng)。另一方面，已知DNA對僅含有兩性離子脂質(zhì)的單層或雙層吸附較弱（如果有的話）；19,21,31,33,67在兩性離子脂質(zhì)DPPC下面，我們看到界面水對DNA濃度增加的微弱光譜響應(yīng)。最后，已知含有兩性離子脂質(zhì)和二價(jià)或更高價(jià)小陽離子的系統(tǒng)既有DNA的中間吸附能，中間最大吸附密度，也有吸附表面電位的中間變化。17-19,31,67對于我們使用DPPC/Ca2+和增加DNA濃度的實(shí)驗(yàn)，界面水的光譜響應(yīng)顯然是中間的。

因此，表面電位的降低似乎定性地解釋了吸附在脂質(zhì)單層上的DNA的VSF水信號(hào)的減少。我們之前使用簡單的表面絡(luò)合+Gouy-Chapman（SCGC）模型，通過調(diào)節(jié)陽離子脂質(zhì)的界面場，對導(dǎo)致VSF光譜振幅降低的DNA吸附進(jìn)行了定量描述。48該模型的邏輯（我們采用的特定公式僅適用于DNA吸附到陽離子脂質(zhì)的情況）是，增加DNA的體積濃度對陽離子單層下方VSF OD拉伸強(qiáng)度的影響是減少有效表面電荷，從而降低表面電位（古伊-查普曼方程無法量化）。考慮到這種方法沒有明確解釋DNA吸附自由能的熵貢獻(xiàn)，也沒有考慮到隨著DNA體積濃度的變化，界面水結(jié)構(gòu)的變化，這種方法的效果出人意料地好。

為了使SCGC模型適用，界面水結(jié)構(gòu)不能隨界面DNA濃度的變化而變化。如果發(fā)生任何此類變化，我們預(yù)計(jì)它們會(huì)導(dǎo)致界面水OD延伸的中心頻率發(fā)生偏移。與本文報(bào)道的實(shí)驗(yàn)類似，將NaCl添加到DPTAP單層下方的水相中，48并將各種離子添加到CaF2 68和Alumina69下方的水相中，表明界面水鍵拉伸的中心頻率沒有變化：添加離子似乎只會(huì)減弱界面D2O（H2O）的OD（OH）拉伸。與這些系統(tǒng)類似，隨著DNA濃度的增加，DPPC和DPPC/Ca2+系統(tǒng)在D2O中OD拉伸的中心頻率沒有明顯變化（見圖2面板C和D）。因此，觀察到的DPPC和DPPC/Ca2+系統(tǒng)與DNA相互作用時(shí)的水響應(yīng)變化與由于脂質(zhì)與聚陰離子DNA相互作用導(dǎo)致的DC界面場變化一致。

然而，如上所述，DPTAP/DNA（圖2A）或diC14氨基/DNA（圖2B）系統(tǒng)的情況更不透明。對于這些系統(tǒng)，光譜響應(yīng)明顯發(fā)生顯著變化，但通過檢查圖2中的數(shù)據(jù)，很難判斷這些變化是否可以純粹由線形或光譜振幅的變化來解釋。正如我們之前所討論的，由于與分子內(nèi)和可能的分子間耦合相關(guān)的效應(yīng)，在這種情況下提取界面水的中心頻率變化是困難的。57-59這種分子內(nèi)耦合使得很難通過檢查和將數(shù)據(jù)與等式1中的線形模型進(jìn)行擬合來確定基礎(chǔ)OD（OH）拉伸模式的中心頻率或?qū)挾仁欠耠SDNA的添加而改變。57,58這個(gè)問題是使用VSF光譜研究界面水的一般問題。正如我們之前所指出的，并證明了水和二氧化硅/水界面上的幾種不同的脂質(zhì)單層，通過檢查HOD的OD延伸而不是D2O，可以克服這種復(fù)雜性。59這種方法的結(jié)果，對于雙14-氨基體系，如圖5所示。從這些HOD數(shù)據(jù)可以明顯看出，HOD共振的中心頻率向更高的頻率偏移了≈80 cm-1，隨著DNA體積濃度的增加。

圖5。HOD在H2O中OD拉伸頻率窗口的光譜，給出了在diC14氨基單層下含有增加濃度DNA的磷酸鹽緩沖亞相。HOD的OD拉伸光譜只有一個(gè)單峰結(jié)構(gòu)，并且清楚地表明，隨著DNA濃度的增加，共振振幅降低，共振向更高的頻率移動(dòng)。

觀察到OD拉伸共振頻率的變化，證明了界面水的結(jié)構(gòu)隨著DNA的吸附而發(fā)生變化。因此，與我們之前的結(jié)論相反，陽離子脂質(zhì)的界面水VSF強(qiáng)度的降低不能完全由表面電位的降低來解釋。48也就是說，添加陽離子脂質(zhì)的DNA后，界面水明顯重組。隨著DNA濃度的增加，HOD譜向更高頻率移動(dòng)，這表明界面水的平均氫鍵強(qiáng)度降低。例如，在反膠束中所含的欠配位水中，已經(jīng)觀察到平均氫鍵強(qiáng)度弱于水在本體中所經(jīng)歷的氫鍵強(qiáng)度。70,71

因此，我們觀察到，隨著吸附在陽離子脂質(zhì)上的DNA濃度的增加，低頻OD拉伸峰（圖2中的透明紅色矩形）移向更高的頻率，而隨著吸附在兩性離子脂質(zhì)上的DNA濃度的增加，這種模式的中心頻率沒有明顯的變化。我們和其他人之前對小離子在不同界面上吸附的觀察表明，與兩性離子脂質(zhì)/DNA的情況類似，中心頻率沒有變化。48,68,69由于單個(gè)帶負(fù)電荷的堿基的分子足跡是有序的，因此脂質(zhì)頭基的大?。ㄏ鄬τ陉庪x子如Cl-）和DNA鏈的吸附能比小離子的吸附能大得多，聚合物DNA的吸附明顯擾亂了界面水結(jié)構(gòu)，而單體離子的吸附則沒有，這也許并不奇怪。

要理解為什么吸附在陽離子脂質(zhì)單層上的DNA會(huì)改變界面水結(jié)構(gòu)，而吸附在兩性離子脂質(zhì)上的DNA不會(huì)改變界面水結(jié)構(gòu)，則更為微妙。之前的X射線散射和衍射研究已經(jīng)闡明，DNA與陽離子脂質(zhì)的結(jié)合是化學(xué)計(jì)量的：對于雙組分（一種陽離子脂質(zhì)、一種兩性離子脂質(zhì)和DNA）脂復(fù)合物，觀察到吸附的DNA量隨著相對陽離子脂質(zhì)濃度的增加而線性增加（在很大范圍內(nèi)），12,13,15,72而對于單組分陽離子脂質(zhì)單層，吸附的DNA密度隨著總脂質(zhì)密度的增加而線性增加。73這些觀察結(jié)果的含義是，人們可能會(huì)寫出一個(gè)化學(xué)上真實(shí)的公式，描述單個(gè)DNA堿基與單個(gè)陽離子脂質(zhì)分子的結(jié)合。更定量地說，在Mg2+存在下，對吸附在陽離子脂質(zhì)甲基三十八烷基溴化銨和兩性離子脂質(zhì)1,2-二吡啶基磷脂酰乙醇胺單層上的DNA的X射線反射研究表明，在與我們的實(shí)驗(yàn)類似的脂質(zhì)密度下，陽離子單層上的鏈間距達(dá)到≈30?而兩性離子單層膜上的是≈42?.17,18,73在二價(jià)陽離子Mg2+、Mn2+、Ca2+和Co2+存在下對DNA和陽離子脂質(zhì)的脂復(fù)合物的研究表明，在臨界離子濃度以上（由于2D離子凝聚），可能會(huì)出現(xiàn)更小的鏈間間隔，但這一現(xiàn)象尚未針對單層進(jìn)行探索。15最后，與這些實(shí)驗(yàn)研究一致的是，簡單的熱力學(xué)論證表明，吸附在陽離子脂質(zhì)單層上的每個(gè)DNA分子都將平鋪（見Wurpel等人48的支持信息）?？偟膩碚f，這項(xiàng)先前的工作描繪了DNA以相對較高的表面覆蓋率吸附到陽離子脂質(zhì)上的圖片，其方式與脂質(zhì)環(huán)境有關(guān)，并為小陽離子提供了獨(dú)特的界面環(huán)境。鑒于這種界面環(huán)境在DNA、脂質(zhì)和小陽離子方面是高度結(jié)構(gòu)化的，我們希望提出一個(gè)問題，這個(gè)順序?qū)ψ罱K主要界面化學(xué)物種水的光譜響應(yīng)有什么影響？

由于已知水化脂質(zhì)頭基團(tuán)經(jīng)歷高度非均相氫鍵環(huán)境，58,59,63,74-78我們預(yù)計(jì)DNA對陽離子脂質(zhì)的吸附將以兩種方式影響界面水的光譜響應(yīng)。首先，界面上的水分子數(shù)量減少：DNA取代了水。由于水在脂類附近經(jīng)歷了一個(gè)不均勻的氫鍵環(huán)境，并且由于DNA不可能以同樣的效率置換所有這些類型的界面水，因此這種脫水（正如我們觀察到的）預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致潛在模式的中心頻率發(fā)生移移移，同時(shí)振幅降低。第二，由于已知DNA陽離子脂質(zhì)復(fù)合物的化學(xué)計(jì)量比，已知陽離子脂質(zhì)上的DNA吸附密度高，并且已知吸附的DNA會(huì)創(chuàng)造一種獨(dú)特的離子環(huán)境，因此我們希望看到一種在沒有DNA的情況下不存在的界面水。

只有當(dāng)DNA吸附到陽離子脂質(zhì)上時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)額外的水結(jié)構(gòu)類型，這一預(yù)期表明，只有當(dāng)DNA吸附到陽離子脂質(zhì)上時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)OD模式。如前所述，2675 cm-1峰值最容易理解為這種模式。雖然在大量水的紅外測量中不存在，但在各種不同的系統(tǒng)中都可以看到界面水的多個(gè)分離良好的共振。到目前為止，最常見的例子是出現(xiàn)在空氣/水界面上的自由和氫鍵OD共振（見里士滿、戈帕拉克里希南等人、艾倫等人的評(píng)論，以及其中的參考文獻(xiàn)53,54,56）。在其他系統(tǒng)中，多個(gè)分離良好的界面水共振出現(xiàn)的頻率低于游離OD（OH）的頻率不太常見，但在一些簡單表面活性劑和磷脂Langmuir單分子膜的VSF研究中已觀察到。61,79同樣，在部分水合Nafion膜和聚合物系統(tǒng)的紅外吸收研究中也觀察到了分裂OH拉伸模式。80,81對于Langmuir單層和Nafion膜研究，更高頻率模式的起源歸因于存在于相對疏水微環(huán)境中的水分子。對于水合聚合物材料，這些峰歸因于與相對非極性酯氧鍵合的水。81

受之前這項(xiàng)工作的啟發(fā)，似乎很清楚，兩種分子情景，或其組合，可以解釋2675 cm-1峰的出現(xiàn)。首先，我們可以想象水分子相對獨(dú)立于大量水，與其他水分子相比，水分子向較弱的受體提供氫鍵。第二，幾何因素導(dǎo)致的集體效應(yīng)，限制使某些水分子亞群不可能滿足其全部氫鍵配額。雖然很難確定這兩種情況中的哪一種或某種組合更適合DNA/陽離子脂質(zhì)系統(tǒng)，但值得強(qiáng)調(diào)的是，VSF對磷脂單分子膜下的水的研究，單糖溶劑化的IR研究，部分水合雙層疊層的紅外光譜研究也沒有顯示出這種分離的水鍵拉伸振動(dòng)。63,75-78,82綜上所述，這些研究表明，在DNA存在的情況下，這種2675 cm-1的出現(xiàn)可以最容易地解釋為一種欠協(xié)調(diào)的承壓水物種的出現(xiàn)，類似于之前提出的在此類系統(tǒng)中的二價(jià)陽離子。15注意，我們在DPTAP上吸附的DNA（具有相對非極性的酯氧）和diC14-氨基（不具有）上都看到了這種模式，這一事實(shí)澄清了這個(gè)峰值不太可能是水氫鍵與相對非極性受體的結(jié)果。

雖然已知DNA以化學(xué)計(jì)量的方式吸附到陽離子脂質(zhì)單分子膜上，但之前的許多研究表明，吸附到兩性離子脂質(zhì)DPPC上的DNA并非如此。16-19,21在這個(gè)系統(tǒng)中，在沒有Ca2+或其他多價(jià)離子的情況下，DNA的吸附非常弱，并且在這種離子存在的情況下，不會(huì)以化學(xué)計(jì)量方式吸收：在存在過量DNA和大量Ca2+的情況下，觀察到被吸附DNA的表面密度與脂質(zhì)密度無關(guān)。18,31,33這種吸附缺乏特異性被認(rèn)為是單層中相對較高的Ca2+遷移率的結(jié)果（導(dǎo)致每個(gè)DNA鏈感覺到一個(gè)平均的鈣吸附場）。在沒有Ca2+的情況下，DNA對DPPC的弱吸附及其在該離子存在下的非特異性吸附都與低頻OD拉伸峰在振幅降低時(shí)沒有移動(dòng)以及2675 cm-1處沒有峰相一致。這兩種觀察結(jié)果最容易理解為一種結(jié)構(gòu)化的、化學(xué)計(jì)量比的DNA/脂質(zhì)復(fù)合物的結(jié)果，該復(fù)合物也會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)化的、相對受限的界面水，對于含有DNA和DPPC的系統(tǒng)來說，兩者都不存在。

脂質(zhì)尾部CH模式的光譜響應(yīng)。如果我們回到圖2所示的數(shù)據(jù)，很明顯在2800-2950 cm-1區(qū)域（透明的藍(lán)色矩形）也有幾個(gè)峰值。在幾十年的紅外吸收和自發(fā)拉曼測量的基礎(chǔ)上，利用脂類單層或簡單表面活性劑的VSF光譜進(jìn)行的先前研究已經(jīng)確定，該光譜區(qū)域包含六種CH拉伸模式：CH2對稱拉伸、CH3對稱拉伸、，CH2對稱拉伸和彎曲泛音的費(fèi)米共振，CH2不對稱拉伸，CH3不對稱拉伸和CH3對稱拉伸和彎曲泛音的費(fèi)米共振。52,74,83-86因?yàn)榻缑婀庾V中這六個(gè)峰的出現(xiàn)是每個(gè)模式的橫截面、VSF設(shè)置的光譜分辨率和單層結(jié)構(gòu)的函數(shù)，在許多系統(tǒng)中，只有一部分是明顯的。圖6顯示了DPTAP和雙14氨基單分子膜（在沒有DNA的情況下）的情況。

圖6。diC14 amdine在26 mN/m（灰色）下的SFG光譜（點(diǎn)）和DPTAP（黑色）在20 mN/m下的SFG光譜（點(diǎn)）。垂直線表示亞甲基對稱拉伸（CH2SS）、甲基對稱拉伸（CH3SS）、亞甲基非對稱拉伸費(fèi)米共振（CH2FR）、亞甲基非對稱拉伸（CH2AS）的位置，甲基對稱拉伸費(fèi)米共振（CH3FR）和甲基不對稱拉伸（CH3AS）。為清晰起見，DPTAP頻譜偏移。實(shí)體曲線使用洛倫茲模型擬合數(shù)據(jù)。

我們和其他人之前的許多工作已經(jīng)表明，可以使用CH拉伸光譜的變化（例如，作為表面壓力或膽固醇濃度的函數(shù)）作為單層中脂質(zhì)尾部局部有序性的探針。尤其是87-90，我們對脂質(zhì)尾部順序的度量是CH3模式的強(qiáng)度與CH2模式的強(qiáng)度之比。這樣的比率是一個(gè)有序的探針，因?yàn)樵诘椭芏认?，末端甲基傾向于彼此隨機(jī)定向，因此，平均而言，幾乎不會(huì)產(chǎn)生VSF信號(hào)。相比之下，在高脂密度下，尾巴被認(rèn)為是緊湊的全反式排列。在這種配置中，終端CH3指向相似的方向（從而產(chǎn)生強(qiáng)VSF信號(hào)），而單個(gè)CH2基團(tuán)與其相鄰基團(tuán)具有反轉(zhuǎn)對稱性（從而減少亞甲基相關(guān)模式中的VSF信號(hào)）。在這里，我們特別感興趣的是DNA吸附對雙14氨基尾序列的影響。在此之前的工作之后，87-90我們通過擬合CH拉伸頻率區(qū)域中的原始數(shù)據(jù)，提取相關(guān)CH強(qiáng)度，確定CH3SS/CH2SS的比率，以及測量雙氰胺單層在存在和不存在DNA的情況下的壓縮等溫線來解決這一主題。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖7所示。

圖7。（上圖）在不存在（紅線）和存在（藍(lán)線，150μm）DNA的情況下，磷酸緩沖亞相上方的diC14氨基單層的π-面積等溫線。對于給定的脂質(zhì)密度，將DNA添加到亞相會(huì)導(dǎo)致表面壓力增加，或者相當(dāng)于脂質(zhì)分子的凝聚。（下圖）不同濃度的DNA溶液上的CH2SS和CH3SS共振（三角形和圓形，右軸）的VSF強(qiáng)度及其比率R（正方形，左軸）。實(shí)線是眼睛的向?qū)А?

圖7（上圖）所示的壓縮等溫線清楚地表明，DNA對diC14氨基單層膜的影響，在很大的密度范圍內(nèi)，是增加表面壓力，或等效地降低表面張力。也就是說，加入DNA后，表面生成的自由能總是變得更有利。然而，在沒有進(jìn)一步信息的情況下，這些實(shí)驗(yàn)幾乎無法深入了解表面熱力學(xué)變化的分子基礎(chǔ)。雙14-氨基單分子膜的CH區(qū)域的VSF光譜作為DNA濃度的函數(shù)，以及由此產(chǎn)生的CH3SS/CH2 SS比率，提供了這樣的見解。如圖7（下圖）所示，向亞相添加DNA，即使在40 pM以下的體積濃度下，也會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)尾部順序的強(qiáng)烈增加。在解釋電子自旋共振研究的結(jié)果時(shí)，貝納蒂及其同事曾認(rèn)為，吸附的DNA使凝膠相雙氰胺雙層（低于23°C）流態(tài)化，并使液相雙層（高于23°C）僵化，從而有效地平滑了在沒有DNA的情況下急劇的熱相變。91我們的光學(xué)和壓力等溫線測量都是在略低于熔融溫度的情況下進(jìn)行的。我們的壓縮等溫線表明，DNA的作用是增加表面上單個(gè)鏈之間的相互作用（降低表面張力），而光學(xué)測量表明，鏈相互作用的增加導(dǎo)致脂質(zhì)尾部更有序。有趣的是，這些結(jié)果與這樣一種情況是一致的，即DNA的加入似乎會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)，兩者之間的相互作用比沒有DNA時(shí)更強(qiáng)烈，尾巴比沒有DNA時(shí)更有序，鏈的流動(dòng)性增強(qiáng)。這種脂鏈流動(dòng)性和脂鏈順序的解耦類似于之前觀察到的膽固醇和DPPC混合物隨溫度變化的情況。92

總結(jié)和結(jié)論

了解脂質(zhì)復(fù)合體中DNA/脂質(zhì)關(guān)聯(lián)的分子水平的詳細(xì)相互作用有可能從根本上改善基因治療。雖然許多研究人員已經(jīng)證明了結(jié)構(gòu)探測技術(shù)（主要是X射線和中子反射和衍射）對這些系統(tǒng)的適用性，但光譜研究，尤其是那些直接探測分子間相互作用的研究，頻率要低得多。缺乏應(yīng)用這些技術(shù)來研究脂叢形成的部分原因可以理解為，難以應(yīng)用光譜技術(shù)來描述本質(zhì)上是界面的現(xiàn)象，而光譜技術(shù)是體敏的。在這里，我們通過應(yīng)用振動(dòng)和頻光譜學(xué)來研究脂質(zhì)/DNA關(guān)聯(lián)，從而繞過了這個(gè)問題。我們以界面重水分子的OD拉伸為報(bào)告，間接研究了DNA與脂質(zhì)頭基的絡(luò)合，并以陽離子脂質(zhì)雙14酰胺尾的CH拉伸模式，直接研究了吸附的DNA對單層結(jié)構(gòu)的影響。

我們發(fā)現(xiàn)，光譜響應(yīng)中最顯著的差異與靜電學(xué)的變化有關(guān)：陽離子脂質(zhì)下界面D2O的OD拉伸的振幅和線型比兩性離子脂質(zhì)DPPC下的OD振幅和線型對DNA濃度的增加更敏感。對于DPPC/DNA/Ca2+系統(tǒng)，觀察到一種介于陽離子脂質(zhì)/DNA和DPPC/DNA之間的反應(yīng)，這與之前的工作一致，之前的工作提出Ca2+的作用是部分中和DPPC磷酸基團(tuán)，使兩性離子DPPC多少呈陽性，從而使脂質(zhì)/DNA結(jié)合。16-19,21

對這四個(gè)體系中DNA濃度增加時(shí)OD拉伸反應(yīng)的更詳細(xì)研究表明，對于陽離子脂質(zhì)，而不是兩性離子脂質(zhì)，額外的高頻OD峰僅在DNA存在時(shí)出現(xiàn)。這一峰值的存在可以很容易地解釋為由不協(xié)調(diào)的水物種造成的。要使這種物種在VSF光譜中可見，它必須在顯微鏡下有序（即在分子長度尺度上破壞反轉(zhuǎn)對稱性）。X射線研究表明，陽離子脂質(zhì)/DNA系統(tǒng)具有良好的有序性，且吸附的DNA鏈間距較小。12,13,15,72我們的水質(zhì)結(jié)果與這樣一個(gè)有序的環(huán)境是一致的。與DNA/陽離子脂質(zhì)系統(tǒng)的X射線研究相比，DNA/兩性離子脂質(zhì)系統(tǒng)的研究表明，在沒有二價(jià)陽離子的情況下，DNA幾乎沒有吸附，而在Ca2+存在的情況下，DNA的非特異性吸附具有較低的鏈間順序。16-18因此，這種系統(tǒng)沒有明顯的2675 cm-1峰值的觀察結(jié)果也與這里的X射線結(jié)果一致。

對于兩性離子脂質(zhì)，通過D2O亞相收集的光譜檢查表明，隨著DNA濃度的增加，中心頻率沒有變化，只是光譜振幅降低。對于陽離子脂質(zhì)下面的OD拉伸，響應(yīng)確實(shí)會(huì)發(fā)生變化，但對于D2O，這種變化很難量化，部分原因是這種共振具有明顯的雙峰性質(zhì)。我們通過關(guān)注HOD的OD拉伸光譜隨diC14脒下DNA濃度增加的變化來克服這個(gè)問題。這些結(jié)果表明，隨著DNA的加入，共振的振幅降低，并移向更高的頻率。這一觀察到的藍(lán)移與我們從這些系統(tǒng)2675 cm-1峰的出現(xiàn)中得出的結(jié)論一致：低頻OD拉伸峰揭示了僅在DNA存在的情況下發(fā)生的界面水的結(jié)構(gòu)形式的信息。

最后，我們還通過測量存在和不存在DNA時(shí)的壓縮等溫線，以及檢查作為DNA濃度函數(shù)的CH拉伸頻率區(qū)域的演變，研究了DNA吸附改變二氫吡啶脂質(zhì)順序和堆積的方式。π/面積實(shí)驗(yàn)表明，在所有脂質(zhì)密度中，DNA的存在導(dǎo)致脂質(zhì)單層的表面張力降低。CH頻率范圍的光譜顯示，添加DNA的效果是使脂質(zhì)尾部有序（在有DNA的情況下，平均而言，雙14-氨基尾部比沒有DNA的情況下更接近全反式構(gòu)象）。這一結(jié)構(gòu)信息補(bǔ)充了通過其他手段（如電子自旋共振）獲得的信息，并與之前的研究一起呈現(xiàn)了一幅有趣的圖片，在我們的實(shí)驗(yàn)溫度下，脂質(zhì)尾部順序和鏈流動(dòng)性是解耦的。

總的來說，我們的結(jié)果在很大程度上證實(shí)了之前許多X射線和中子研究的預(yù)期，并提供了關(guān)于界面水在DNA/脂質(zhì)相互作用中的作用的額外信息，這些工具無法實(shí)現(xiàn)。更一般地說，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在DNA/脂質(zhì)相互作用的研究中，VSF光譜補(bǔ)充了更常用的結(jié)構(gòu)探針的方式。我們相信，這里給出的結(jié)果只是初步了解了VSF光譜在這一重要系統(tǒng)中可能的應(yīng)用。例如，未來VSF光譜學(xué)在DNA/脂質(zhì)系統(tǒng)中的應(yīng)用應(yīng)該能夠?yàn)槟承╆栯x子脂質(zhì)單分子膜上發(fā)生的DNA雙鏈體分裂提供明確證據(jù)（目前根據(jù)X射線實(shí)驗(yàn)93中測量的吸附DNA厚度推斷）。此外，在更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)中，人們可能會(huì)想象，正如我們中的一些人最近為更簡單的系統(tǒng)所證明的那樣，94在存在和不存在DNA的情況下，探測界面水和脂質(zhì)官能團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移，以進(jìn)一步了解在這些條件下水域局部環(huán)境如何變化。

致謝

這項(xiàng)工作是“粘著voor Fundamenteel Onderzoek der Materiale（FOM）”研究項(xiàng)目的一部分，該項(xiàng)目由“荷蘭voor Wetenschapelijk Onderzoek（NWO）組織”資助?，旣悺ぞ永铮∕arie Curie）即將獲得的國際獎(jiǎng)學(xué)金（R.K.C.）提供了進(jìn)一步的資助。

可用支持信息：完整參考文獻(xiàn)3。該材料可通過互聯(lián)網(wǎng)http://pubs免費(fèi)獲取。acs。組織。