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Delta-8 動(dòng)物胃腸道體內(nèi)中藥物的溶解度的測(cè)定——材料和方法
來(lái)源:上海謂載 瀏覽 991 次 發(fā)布時(shí)間:2021-11-26
材料和方法
材料
美沙拉秦(也稱為美沙拉秦或5-ASA,水溶性1.32 mg/ml,[11]log P 0.98[13])來(lái)自Sigma-Aldrich(英國(guó)多塞特),潑尼松龍(log P 1.59[14])來(lái)自塞文生物技術(shù)有限公司(英國(guó)伍斯特郡)。水、甲醇、不含過(guò)氧化氫的四氫呋喃和三氟乙酸從Fisher Scientific(英國(guó)拉夫伯勒)購(gòu)買,為HPLC級(jí)。緩沖容量測(cè)定用NaOH和HCl的容量標(biāo)準(zhǔn)從Sigma-Aldrich處獲得。
胃腸組織
所有程序均由內(nèi)政部批準(zhǔn)(PPL編號(hào)70/6421),并根據(jù)英國(guó)1986年《動(dòng)物(科學(xué)程序)法》進(jìn)行。豬的胃腸道是在切勒肉類有限公司(英國(guó)埃塞克斯)的屠宰場(chǎng)從新鮮殺死的雄性動(dòng)物(大白種和長(zhǎng)白種雜交,n=3,95–110千克,6個(gè)月)獲得的。成年新西蘭大白兔(n=6,2.1-2.3 kg,9-10周)和Wistar大鼠(n=8220-255 g,8周)購(gòu)自英國(guó)哈蘭有限公司(英國(guó)牛津郡)。所有動(dòng)物都可以自由飲水,并在處死前自由進(jìn)食:兔子,實(shí)驗(yàn)室飲食5322,添加維生素C(英國(guó)諾丁漢郡IPS);豬,Eltabreed Bingle母豬蛋糕-豬用復(fù)合飼料(ABN有限公司,英國(guó)彼得伯勒);大鼠,Teklad全球18%蛋白質(zhì)嚙齒動(dòng)物飲食(哈蘭有限公司)。
胃腸液
所有測(cè)量均在從動(dòng)物胃腸液中獲得的上清液上進(jìn)行。處死動(dòng)物,將胃腸道分為胃、小腸、盲腸和結(jié)腸。如前所述,進(jìn)一步細(xì)分小腸和結(jié)腸。[6,12]將胃腸液轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?,然后?3200 rpm的轉(zhuǎn)速離心(德國(guó)漢堡Eppendorf AG 5415D離心機(jī))(~16 110×g rcf)保存20分鐘。上清液在–80°C下保存,直至分析。由于大鼠胃腸道的液體容量有限,根據(jù)解剖位置收集了8只大鼠的液體,包括胃、小腸(近端、中部和遠(yuǎn)端)、盲腸和結(jié)腸。這些液體的緩沖容量、滲透壓和表面張力的特征如下所述。還測(cè)定了藥物在這些液體中的溶解度。所有測(cè)量均以一式三份進(jìn)行。由于來(lái)自大鼠的液體的匯集性質(zhì),所述標(biāo)準(zhǔn)偏差代表分析變異性;然而,對(duì)于兔子和豬來(lái)說(shuō),它代表了動(dòng)物間的變異性。
滲透壓
使用數(shù)字微滲透計(jì)(5R型)(德國(guó)柏林Hermann Roebling Messtechnik)測(cè)定胃腸液上清液的滲透壓,其中滲透壓是利用冰點(diǎn)降低理論測(cè)量的。每次測(cè)量使用100μl的體積。
表面張力
使用Delta-8管理軟件(版本3.8)控制的Delta 8張力計(jì)(芬蘭埃斯波Kibron公司)測(cè)量表面張力。使用DynePlates(為張力計(jì)設(shè)計(jì)的96孔板)進(jìn)行測(cè)量,每個(gè)孔中有50μl上清液。
pH值和緩沖容量
使用配有FC202電極的pH計(jì)(HI99161)測(cè)量GI上清液的pH值和緩沖容量,該電極用于測(cè)量粘性和半固體材料(Hannah Instruments,Bedfordshire,UK)。在pH值變化為0.5和1.0單位時(shí),通過(guò)向胃腸液中的300μl上清液樣品中添加小份HCl(用于腸液)或NaOH(用于胃液)來(lái)測(cè)量緩沖液容量,以達(dá)到所需的pH值變化。然后使用以下方程式計(jì)算緩沖容量:
式中,Ma是酸的摩爾濃度,Va是酸的體積(單位:毫升),Vb是緩沖液的體積(單位:毫升),ΔpH是pH單位的變化。
溶解度研究
樣品處理和溶解度測(cè)量
過(guò)量的毒品(~20毫克強(qiáng)的松龍或~將15mg美沙拉秦)添加到含有200μl胃腸液上清液的微離心管(Eppendorf AG)中。然后將樣品置于振蕩?。ㄓ?guó)拉夫伯勒加倫坎普)中,溫度保持在37°C,轉(zhuǎn)速為170 rpm。24小時(shí)后,以5000 rpm的轉(zhuǎn)速離心樣品(~4472×g rcf)在37°C下放置10分鐘(離心機(jī)5804R,Eppendorf AG)。將上清液依次轉(zhuǎn)移至離心過(guò)濾管(康寧Spin-X,0.22μm醋酸纖維素膜,從英國(guó)萊斯特郡費(fèi)希爾科學(xué)公司獲得),然后以5000 rpm離心(~4472×g rcf)在37°C下放置20分鐘(離心機(jī)5804R,Eppendorf AG)。在分析之前,取下等份濾液(50μl)并用1950μl流動(dòng)相稀釋。該方法之前已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證[11],以避免藥物在生物液體中降解或與過(guò)濾器結(jié)合而影響溶解度結(jié)果。
分析方法
使用先前報(bào)告的方法,通過(guò)配備紫外線檢測(cè)器(安捷倫科技1200系列,加利福尼亞州圣克拉拉)的反相高效液相色譜法測(cè)定樣品中溶解的潑尼松龍或美沙拉秦的量。[11]空白胃腸液樣品(來(lái)自“樣品處理和溶解度測(cè)量”部分的無(wú)藥物上清液)也以與測(cè)試溶解度的樣品相同的方式分析,以排除在藥物保留時(shí)間出現(xiàn)干擾峰的可能性。空白樣品以與樣品相同的方式稀釋,過(guò)濾并隨后分析。色譜條件為:流動(dòng)相(5%甲醇,95%水加0.05%三氟乙酸用于美沙拉秦,68.8%水,25%四氫呋喃和6.2%甲醇用于潑尼松龍);反相柱,水對(duì)稱性C8 5μm 4.6×250mm(美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德沃特斯)用于潑尼松龍,5μm 250×4mm(德國(guó)達(dá)姆施塔特默克)用于美沙拉秦。美沙拉秦和潑尼松龍分別在228nm和254 nm處檢測(cè),保留時(shí)間分別為7.0和9.9分鐘。兩種藥物的剩余分析條件相同(即:20μl注射量,124 bar和40°C柱溫下的流速為1 ml/min)。
統(tǒng)計(jì)分析
總體數(shù)據(jù)通過(guò)單向方差分析進(jìn)行分析,然后使用IBM SPSS Statistics 19(美國(guó)伊利諾伊州芝加哥SPSS Inc.)進(jìn)行Tukey事后分析,置信區(qū)間為95%。使用一元一般線性模型工具,結(jié)合Tukey事后分析,將物種和位置作為固定因素,事后結(jié)果的統(tǒng)計(jì)顯著性為P<0.05。
Delta-8 動(dòng)物胃腸道體內(nèi)中藥物的溶解度的測(cè)定——摘要、介紹
Delta-8 動(dòng)物胃腸道體內(nèi)中藥物的溶解度的測(cè)定——材料和方法